产品货号：
YTC0814
中文名称：
3D培养活细胞内质网染色试剂盒(ER-Tracker Green)
英文名称：
By3D ER-Tracker Green Assay Kit
产品规格：
50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种基于ER-Tracker Green内质网荧光探针的用于3D培养的细胞球或类器官等的活细胞内质网染色的试剂盒。仅需染色20分钟就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的活细胞内质网绿色荧光染色。
ER-Tracker Green为采用Molecular Probes公司的BODIPY FL进行了荧光标记的glibenclamide。Glibenclamide即glyburide，中文名称为格列本脲，是一种常用2型糖尿病的治疗药物，可以高度结合主要定位在内质网上的包含ATP敏感的钾离子通道的磺脲类受体。因此荧光标记的glibenclamide就可以用作内质网特异性的荧光探针。ER-Tracker Green适用于活细胞内质网的荧光染色，但不适合用于固定细胞内质网的荧光染色。ER-Tracker Green呈绿色荧光，检测时最大激发光波长为504nm，最大发射光波长为511nm。
- 适用范围广：本制品可用于各种方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
- 使用便捷：整个检测过程仅需约30分钟即可完成。对于常规的3D细胞活细胞染色，仅需将本试剂盒中的By3D ER-Tracker Green染色液(250×)按照相应比例用By3D ER-Tracker Green Assay Buffer配制成By3D ER-Tracker Green检测工作液，避光孵育20分钟即可进行荧光检测。
| 组分 | 规格 |
| By3D ER-Tracker Green染色液(250×) | 20μL |
| By3D ER-Tracker Green Assay Buffer | 5mL |
保存：-20℃，避光，有效期6个月。
- ER-Tracker Green在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。对于微量的液体，每次使用前先离心数秒钟，使液体充分沉降到管底。
- 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 格列本脲的药理学活性可能会影响内质网的一些功能；某些特殊细胞中磺脲类受体的可变表达可能会导致非内质网特异性染色。
- ER-Tracker Green适用于活细胞内质网的荧光染色，但不适合用于固定细胞内质网的荧光染色。如果经ER-Tracker Green染色后的细胞需要进行固定操作，使用4%多聚甲醛在37℃固定2分钟。
- ER-Tracker Green染色后的细胞不能用Triton X-100通透，Triton X-100通透处理会导致ER-Tracker Green的荧光染色消失。
- 本制品浓度经过百奥莱博的优化，确保可以满足活细胞染色及各种常规染色的需要。如需使用特定浓度的ER-Tracker Green，请选购内质网绿色荧光探针(ER-Tracker Green)。
- 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。
- 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。
- 为达到最佳的使用效果，具体细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预染色效果较好。
- 3D细胞ER-Tracker Green染色：
- By3D ER-Tracker Green染色液(1×)的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL By3D ER-Tracker Green染色液(1×)的量，用By3D ER-Tracker Green Assay Buffer稀释配制适量的By3D ER-Tracker Green染色液(1×)。
样品数 10个样品 50个样品 100个样品 By3D ER-Tracker Green Assay Buffer 1mL 5mL 10mL By3D ER-Tracker Green染色液(250×) 4μL 20μL 40μL 总体积 ~1mL ~5mL ~10mL - 配制好的By3D ER-Tracker Green染色液(1×)必须一次使用完毕，不能冻存。
- By3D ER-Tracker Green染色工作液中的ER-Tracker Green的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。ER-Tracker Green的工作浓度通常为0.5～2×，推荐使用浓度为1×。
- 小心去除原有细胞培养液。每孔加入100μL By3D ER-Tracker Green染色液(1×)，在适宜于细胞培养的温度避光孵育20分钟。
- 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常沉浮在培养板或培养皿等培养器的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
- By3D ER-Tracker Green染色液(1×)的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL By3D ER-Tracker Green染色液(1×)的量，用By3D ER-Tracker Green Assay Buffer稀释配制适量的By3D ER-Tracker Green染色液(1×)。
- 荧光拍摄：染色结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并用完全培养基换液以终止染色，即可在荧光显微镜下观察。ER-Tracker Green为绿色荧光探针，检测时最大激发光波长为504nm，最大发射光波长为511nm。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
图1.本试剂盒对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养72小时，然后吸除培养液后直接加入By3D ER-Tracker Green染色液(1×)染色20分钟(图中各染料可混合配制后使用)。结果显示，By3D ER-Tracker Green染色试剂盒对于3D细胞染色效果清晰、明亮，By3D ER-Tracker Green染色的内质网呈现绿色荧光(图B)，By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色的线粒体呈现红色荧光(图C)，By3D Hoechst 33342染色的细胞核呈现蓝色荧光(图D)，绿色荧光、红色荧光及细胞核蓝色荧光的叠加(Merge)效果见图E。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
传统的细胞培养大多以二维(2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低。三维(3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反映细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果。
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